- Quy trinh lượng hóa carbon
Từ mẫu bùn và mẫu nƣớc thải giàu nitrate thu từ Khu Công nghiệp Lê Minh Xuân, tiến hành phân lập năm chủng vi khuẩn. Trên cơ sở đó, tiến hành sàng lọc khả năng loại bỏ nitrate theo thời gian và chọn đƣợc chủng HLX5 có khả năng loại bỏ nitrate hoàn toàn sau 72 giờ đồng thời hình thành nitrite và amomia thấp hơn tiêu chuẩn cho phép. Trên cơ sở đó, tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng loại bỏ nitrate của HLX5 và đã xác định đƣợc mật độ vi khuẩn bổ sung ban đầu là 106 cfu/ml, nồng độ nitrate đầu vào tốt nhất là 292 mg/l, nguồn carbon bổ sung vào là succinate, pH nƣớc là 5,0. Nghiên cứu này là nền tảng cho các nghiên cứu đánh giá hiệu quả loại bỏ nitrate ở quy mô pilot nhằm mục tiêu ứng dụng xử lí chất giàu nitrate trong thực tế.
Từ khóa: loại bỏ nitrate, phân lập, sàng lọc, vi khuẩn xử lí nitrate, yếu tố ảnh hƣởng.
Trong những năm trở lại đây, vấn đề môi trƣờng ngày càng đƣợc quan tâm bởi những tác động vô cùng to lớn của nó đến nhiều lĩnh vực, ngành nghề trong xã hội. Hòa cùng với xu thế của thế giới, nƣớc ta cũng hƣớng tới mục tiêu phát triển bền vững với rất nhiều các công trình nghiên cứu về xử lí môi trƣờng, đặc biệt là các công trình xử lí nƣớc thải bằng phƣơng pháp sinh học. Xử lí sinh học bằng cách ứng dụng các chủng vi sinh vật có ƣu điểm là phù hợp điều kiện tự nhiên, giảm chi phí năng lƣợng, hóa chất, đơn giản, có khả năng tận dụng các sản phẩm phụ sau xử lí. Trong đó hoạt động của các vi sinh vật giữ vai trò rất quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả xử lí của toàn bộ hệ thống. Một trong những vấn đề cần xử lí hiện nay là vấn đề làm giảm hàm lƣợng nitrate trong nƣớc thải. Việc dƣ thừa hàm lƣợng nitrate trong nƣớc có thể ảnh hƣởng đến sức khỏe của con ngƣời. Khi nitrate xâm nhập vào trong cơ thể với hàm lƣợng cao dƣới tác động của enzyme trong cơ thể, nitrate sẽ đƣợc chuyển hóa thành nitrite ngăn cản các quá trình hình thành và trao đổi oxy của hemoglobin trong máu dẫn đến việc thiếu hụt oxy trong máu, hiện tƣợng này đƣợc gọi là hội chứng ngộ độc nitrate. Hiện nay, có nhiều kĩ thuật xử lí nitrate bằng phƣơng pháp hóa học nhƣng chi phí cho việc xử lí này khá tốn kém. Do đó, việc ứng dụng các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy nitrate
là điều hết sức cần thiết vì mang lại hiệu quả cao đồng thời giảm chi phí cho quá trình xử lí. Để quá trình ứng dụng các chủng vi khuẩn xử lí nitrate vào quá trình xử lí đạt hiệu quả cao thì việc phân lập và tuyển chọn chúng sẽ có ý nghĩa rất lớn trong công tác xử lí nitrate nói riêng và xử lí môi trƣờng nói chung. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguồn mẫu Mẫu bùn và nƣớc thải thu tại các bể xử lí và hố thu tại Nhà máy xử lí nƣớc thải tập trung tại Khu Công nghiệp Long Hậu và Khu Công nghiệp Lê Minh Xuân. Mẫu đƣợc thu từ nguồn thải tại hố thu gom cho vào các chai nhựa. 2.2. Phân lập vi khuẩn xử lí nitrate 2.2.1. Bước đầu khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn xử lí nitrate Các mẫu sau khi đem về phòng thí nghiệm, tiến hành hút 1ml mẫu lỏng (mẫu nƣớc thải và bùn) cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng Giltay có chứa ống Durnham. Tiến hành ủ ở nhiệt độ 30 0C trong 3 ngày. Sau 3 ngày tiến hành quan sát sự sinh khí trong các ống durnham, các mẫu nào sinh khí trong ống durnham đƣợc sử dụng tiếp để định tính khả năng loại bỏ Nitrate bằng thuốc thử diphenylamin, Griess A + Griess B và Nessler, nhằm mục đích định tính sự hiện diện của nitrate, nitrite và amoni trong mẫu. 2.2.2. Phân lập vi khuẩn xử lí nitrate Từ các mẫu sau khi định tính không có sự hiện diện của nitrate, không có sự tạo thành nitrite và amoni trên môi trƣờng Giltay, tiến hành pha loãng và phân lập các chủng vi khuẩn loại bỏ nitrate. Hút 1 ml mẫu trong môi trƣờng Giltay cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc muối sinh lí, ta đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục thực hiện tƣơng tự đến độ pha loãng 10-7. Mẫu sau khi pha loãng tiến hành hút 0,1ml ở 3 nồng độ pha loãng cuối cùng cấy trang trên môi trƣờng DM agar, mỗi độ pha loãng thực hiện trên 2 đĩa, sau đó ủ ở 30 0C trong 48 giờ. Tiến hành chọn lọc các khuẩn lạc vi khuẩn xử lí nitrate dựa vào: hình thái, màu sắc, kích thƣớc khuẩn lạc. Sau đó tiến hành cấy ria nhiều lần trên môi trƣờng tƣơng ứng để thu đƣợc giống thuần. Tiến hành giữ giống trong ống thạch nghiêng chứa môi trƣờng LB agar và trong Glycerol 20 % để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.3. Sàng lọc vi khuẩn có khả năng xử lí nitrate hiệu quả Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập và nhuộm Gram xác định đặc điểm hình thái đƣợc tiếp tục sàng lọc dựa trên hiệu quả loại bỏ nitrate nhằm mục đích chọn ra chủng vi khuẩn có khả năng xử lí nitrate nhanh nhất, hiệu quả nhất, đồng thời những sản phẩm tạo thành không làm ảnh hƣởng đến môi trƣờng cũng nhƣ sức khỏe của con ngƣời. Môi trƣờng DM Broth (chứa KNO3 2g/l) đƣợc sử dụng để sàng lọc các chủng vi khuẩn để loại bỏ nitrate. Các chủng vi khuẩn đƣợc tăng sinh trong erlen chứa 10ml môi trƣờng LB broth trong thời gian 24 giờ trong điều kiện lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng và sau đó tiến hành đó,
OD600nm, xác định mật độ vi khuẩn rồi tiến hành pha loãng mẫu để có đƣợc mật độ vi khuẩn là 108 cfu/ml. Tiến hành cấy vi khuẩn ở mật độ 108 cfu/ml cấy vào erlen chứa 100ml môi trƣờng DM broth và tiến hành thu mẫu khảo sát tại các thời điểm 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ. Đối chứng là môi trƣờng DM, không bổ sung vi khuẩn. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Tại mỗi thời điểm khảo sát tiến hành thu 100 ml mẫu dịch nuôi cấy, ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ sinh khối và thu phần dịch trong. Dịch này đƣợc sử dụng để phân tích hàm lƣợng nitrate, nitrite và amoni. Nitrate đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sử dụng phenoldisulfonic acid. Thu 25 ml dịch sau ly tâm, tiến hành cô cạn mẫu. Sau đó, cho vào 1 ml PDA và 25 ml nƣớc cất. Lắc cho tan đều rồi trung hòa acid đến trung tính bằng NaOH 10 %. Chuyển vào bình định mức 100 ml và định mức cho đủ 100 ml. Đo OD ở bƣớc sóng 410 nm. Nitrite đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sử dụng thuốc thử acid sulphanilic và napthylamine. Thu 25 ml dịch sau ly tâm rồi bổ sung 0,5 ml dung dịch Na-EDTA và 0,5 ml acid sulphanilic và để yên trong 10 phút. Tiếp tục cho 0,5 ml napthylamine và 0,5 ml acetate rồi để yên trong 20 phút. Sau đó đo OD bƣớc sóng 520 nm. Amoni đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sử dụng thuốc thử Nessler. Thu 50 ml mẫu và thêm 0,5 ml ZnSO4 và 0,25ml NaOH 6N, đợi trong khoảng 30 phút đến 45 phút. Sau đó lấy 25 ml mẫu qua lọc thêm 1 giọt EDTA để loại bỏ ion Ca2+, Mg2+ hoặc các ion khác gây kết tủa với Nessler. Sau khi thêm 2 ml Nessler để yên 10 phút, đo OD ở bƣớc sóng 430nm. 2.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng xử lí nitrate Sau khi sàng lọc, chọn đƣợc chủng vi khuẩn HLX5 có khả năng xử lí nitrate hiệu quả nhất. Tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng xử lí nitrate của chủng này nhằm tối ƣu hóa quá trình xử lí nitrate của chúng. 2.4.1. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn ban đầu Mật độ ban đầu ảnh hƣởng lớn đến khả năng xử lí nitrate. HLX5 sau khi đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng LB broth trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, tiến hành đo OD600nm và điều chỉnh về các mật độ khảo sát bao gồm 105, 106, 107, 108, 109 cfu/ml và cấy vào môi trƣờng DM Broth (chứa KNO3 2g/l). Tiến hành khảo sát nồng độ nitrate, nitrite và amoni theo thời gian 0, 6, 12, 24, 48 và 72 giờ. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 2.4.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon Nguồn carbon trong môi trƣờng ảnh hƣởng lớn đến khả năng xử lí nitrate. HLX5 sau khi đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng LB broth trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, tiến hành đo OD600nm và điều chỉnh về các mật độ thích hợp và cấy vào môi trƣờng DM Broth (chứa KNO3 2g/l) chứa các nguồn carbon khác nhau gồm có Na-succinate (2 g/l), methanol và ethanol (2 ml/l). Tiến hành khảo sát nồng độ nitrate, nitrite và amoni theo thời gian 0, 6, 12, 24, 48 và 72 giờ. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét